Ученые выяснили, что гены ВИЧ могут быть успешно удалены из клеток

CDC/Unsplash

Ученые продемонстрировали потенциал технологии CRISPR-Cas9 для удаления генома ВИЧ из ДНК инфицированных клеток. Они также определили некоторые последствия этого и начали исследовать, как можно смягчить эти побочные эффекты.

В одном из исследований доктор Мишель Лай и ее коллеги из Пизанского университета продемонстрировали способность CRISPR-Cas9 удалять генетический материал ВИЧ из инфицированных клеток, а также исследовали, могут ли вырезанные участки ДНК воссоединиться и начать реплицироваться снова.

В другом исследовании доктор Джонатан Херсковиц и его команда из Университета Небраски показали, что при воздействии CRISPR-Cas9 на несколько участков двух наиболее важных генов ВИЧ репликация вируса в инфицированных клетках почти полностью прекращается – без видимого повреждения клеточной ДНК.

Фон

У людей ВИЧ работает, прикрепляясь к клетке и высвобождая свой генетический материал, который затем превращается в ДНК клетки, в которую он вторгся. Затем эта ДНК интегрируется в ДНК хозяина и, если ее действие не подавляется антиретровирусной терапией (АРТ), продолжает создавать новые копии вируса.

CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR Associated Protein 9) – это молекулярный инструмент, основанный на методе, который бактерии используют для удаления вирусного генетического материала, интегрированного в их собственную ДНК. По сути, это позволяет ученым выбрать последовательность известного генетического материала (например, часть последовательности генома ВИЧ) и дать команду ферменту вырезать этот материал из последовательности ДНК. Теоретически это означает, что генетический материал ВИЧ, который хранится в ДНК людей, живущих с ВИЧ, может быть удален.

Что происходит с удаленной вирусной ДНК?

Исследователи из Pisa проверили это предположение в лабораторных условиях (in vitro), а также исследовали, что происходит с вирусной ДНК, которая была вырезана. Сначала они взяли группу клеток и, используя ретровирусный вектор, похожий на ВИЧ, ввели в клетки модифицированную нить ВИЧ-материала. Затем клетки начали вырабатывать белок, который исследователи смогли измерить, предположив, что, как и в случае с ВИЧ-инфекцией человека, когда вирус выделяет свой белок р24, ВИЧ-материал был интегрирован в ДНК клеток.

Затем они ввели комплекс CRISPR-Cas9, который был нацелен на определенную часть материала, содержащего ВИЧ, в надежде, что он удалит вирусную ДНК ВИЧ из инфицированных клеток и, таким образом, прекратит выработку белка.

Они нацелились на область длинного концевого повтора (LTR) – участки на конце каждой нити вирусного генетического материала, которые “включают” механизм клетки-хозяина, чтобы она начала вырабатывать вирусные белки. Исследователи искали признаки того, что в клетках, подвергшихся воздействию CRISPR-Cas9, происходит активная выработка белка ВИЧ, и обнаружили, что через пару дней она действительно почти полностью прекратилась.

Они также хотели посмотреть, что произойдет со всем удаленным вирусным генетическим материалом. Они обнаружили, что он может образовывать небольшие фрагменты кольцевой ДНК, которые сохраняются в клетках в течение как минимум двух недель после введения комплекса CRISPR-Cas9.

Считалось, что в конечном итоге эти фрагменты ДНК распадутся или будут разбавлены в результате повторного деления клеток. Однако, как обнаружили исследователи, иногда они снова соединялись и образовывали целые цепочки генетического материала ВИЧ.

В определенных лабораторных условиях, созданных исследователями с помощью манипуляций, этот генетический материал потенциально мог стать одним из строительных блоков вируса ВИЧ и, таким образом, теоретически мог производить инфекционный вирус, создавая потенциальный барьер для использования CRISPR-Cas9 в качестве полного средства от ВИЧ. Однако эту проблему можно решить путем одновременного, надеюсь, временного, применения антиретровирусной терапии.

Нацеленной на различные гены ВИЧ

Исследователи из Небраски изучили некоторые другие проблемы, с которыми сталкивается технология CRISPR-Cas9. Учитывая, что существуют тысячи штаммов вируса ВИЧ с большим генетическим разнообразием и что ВИЧ продолжает мутировать после заражения, они хотели убедиться, что технология не станет излишней из-за большого количества штаммов, каждый из которых имеет немного отличающийся генетический материал. Кроме того, они изучили, как наилучшим образом такое лечение может быть применено к клеткам человека в реальных условиях (in vivo).

“Существуют препятствия, которые, если их не преодолеть, могут сделать CRISPR-CAS9 просто интересным лабораторным инструментом”.

Эта группа нацелилась на удаление множества различных участков генома ВИЧ, а не на один участок, на который нацелилась первая группа исследователей.

Гены tat и rev ВИЧ кодируют белки, которые заставляют инфицированные клетки быстро вырабатывать гораздо большее количество вируса ВИЧ. Они остаются относительно неизменными у различных штаммов вируса. Исследователи обнаружили, что когда они воздействовали на эти гены одновременно с помощью комплекса CRISPR-Cas9 под названием TatDE, он разрезал вирусную ДНК в нескольких местах. Они смогли почти полностью блокировать размножение вируса в ВИЧ-инфицированных клетках с меньшим отскоком вируса, чем при использовании только LTR, как в исследовании Pisa.

Что касается того, как CRISPR-Cas9 может быть реально доставлен в клетки человека, группа из Небраски использовала различные методы, чтобы понять, какие из них будут эффективными.

Исследователи протестировали технологию мРНК (мессенджерной РНК), аналогичную той, которая используется в недавних вакцинах от COVID-19 Pfizer и Moderna. При этом генетический материал вводится в клетки через маленькие жировые капельки, которые затем начинают вырабатывать комплекс CRISPR-Cas9. Они пришли к выводу, что это очень эффективный способ внедрения CRISPR-Cas9.

Учитывая его доказанную безопасность в качестве метода доставки, мРНК действительно представляет собой захватывающий потенциальный путь для внедрения этой технологии в лабораторных условиях в жизнь человека.

Еще одна проблема, которая была поднята в связи с CRISPR-Cas9, связана с “нецелевыми” изменениями: может ли фермент Cas9, хотя и нацеленный на вирусную ДНК, которая была вставлена в ДНК инфицированных клеток (хозяина), по ошибке вырезать часть собственного генетического материала клетки-хозяина?

Авторы статьи проанализировали клетки, которые подверглись обработке CRISPR-Cas9, и, в частности, изучили области в геноме человека, которые система Cas9 с наибольшей вероятностью может принять за ДНК ВИЧ. Они обнаружили, что ни в одной из этих областей не было такого “нецелевого” редактирования. Однако авторы не изучали всю оставшуюся ДНК клеток, и поэтому остается вероятность того, что нецелевые изменения могли существовать, но просто не были обнаружены.

Прежде чем начать какое-либо исследование на людях, необходимо изучить весь геном; удаление критического гена может иметь ужасные последствия для любого, кто принимает лечение CRISPR-Cas9.

Выводы

Технология CRISPR-Cas9 постоянно развивается. Эти исследования в какой-то мере доказывают, что в лабораторных условиях можно удалить вирусную ДНК из инфицированных клеток человека. Они демонстрируют, что, тестируя различные мишени для фермента Cas9, они могут повысить его эффективность, и изучили возможные и безопасные способы доставки такого препарата в клетки.

Но прежде чем люди, живущие с ВИЧ, и лечащие их врачи обрадуются перспективе излечения, важно отметить, что эти исследования проводились в контролируемых лабораторных условиях с использованием узкого спектра клеточных линий. Для того чтобы это лечение было эффективным у людей, оно должно охватить и обеспечить эффективность в каждой клетке, в которую встроена ДНК ВИЧ. Необходимо провести полное секвенирование генома нескольких клеточных линий, прежде чем можно будет полностью убедиться в отсутствии вредных или даже потенциально смертельных “нецелевых” изменений.

Несмотря на это, необходимо ответить на другие вопросы, например, как долго следует продолжать антиретровирусную терапию после лечения с помощью CRISPR-Cas9. Хотя эти результаты многообещающие, в настоящее время эти исследования по-прежнему являются лишь подтверждением концепции. Дальнейшие исследования будут сосредоточены на том, как превратить технологию CRISPR-Cas9 в эффективное и безопасное средство лечения ВИЧ, но существуют препятствия, которые, если их не преодолеть, могут превратить CRISPR-CAS9 в интересный лабораторный инструмент.

https://doi.org/10.1128/JVI.01358-21