Триша Бурдо на выставке CROI 2019. Фото Лиз Хайлейман.
Главной темой конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям (CROI 2019), прошедшей на этой неделе в Сиэтле, стала возможность второго излечения от ВИЧ. Однако лечение включало в себя дорогостоящую и рискованную терапию – трансплантацию костного мозга, – которая никогда не будет широко применяться.
Не менее важным в долгосрочной перспективе может быть исследование, о котором сообщалось на том же сеансе, в котором использовались гораздо более щадящие технологии для достижения того, что может быть излечено на обезьянах.
Группа исследователей из Университета Темпл в Филадельфии, США, удалила ретровирусные гены из клеток обезьян, инфицированных SIV, обезьяньим аналогом ВИЧ. Исследователи обнаружили, что используемый ими фермент, расщепляющий гены, содержащийся в оболочке обычного вируса простудного типа, чтобы он мог имитировать инфекцию и проникать в клетки, успешно удалил гены SIV из большинства – а возможно, и из всех – клеток во всех органах обезьян, уровни которых были измерены, включая к таким труднодоступным областям, как мозг.
Поскольку обезьяны, участвовавшие в этом эксперименте, были подвергнуты эвтаназии после вмешательства, чтобы можно было взять биопсию всех тканей, мы не можем сказать, можно ли считать то, чего достигли исследователи, излечением от ВИВ. Но всеобъемлющий характер результатов впечатляет, и любая попытка культивировать SIV из иммунных клеток в крови обработанных обезьян в ходе так называемого анализа вирусного роста не приводила к получению вируса. Следующим шагом будет проведение такой же терапии обезьянам, получающим антиретровирусную терапию (АРТ), с положительным ВИВ, а затем прерывание лечения, чтобы выяснить, появится ли ВИВ снова.
Эксперимент
Технология сплайсинга генов была первоначально применена к SIV в исследованиях, о которых сообщила в 2016 году та же исследовательская группа. Активные компоненты вирусного вектора (оболочки) состоят из двух компонентов. Во–первых, вектор содержит участки направляющей РНК (gRNA), задача которых заключается в поиске последовательностей SIV в геноме обезьян – он может обнаруживать и связывать с определенными последовательностями в SIV, которые являются высококонсервативными, т.е. не сильно меняются от одной разновидности SIV к другой. Во-вторых, он также содержит фермент под названием CRISPR/Cas9, который “вырезает” генетический материал SIV и соединяет срезанные концы, заменяя длинную последовательность SIV короткой генетической последовательностью, которая служит сигналом о том, что произошло удаление гена.
Дальнейшие исследования, проведенные в 2016 году, показали, что в ДНК SIV вскоре появились мутации, которые привели к резистентности – она нашла способ стать “невидимой” для gRNA. В то время мы отмечали, что разрушающий ген Cas9 необходимо было бы присоединить к множеству различных gRNA, чтобы избежать этого, и именно это было сделано в новом исследовании. gRNA позволили удалить три различных участка SIV, что позволило снизить вероятность появления ускользающих мутантов. Два из этих генных изменений включали удаление почти всего генома SIV; третье включало удаление более короткого, но все еще значительного участка вирусного генома, составляющего около 10%, и его замену последовательностью, предназначенной в качестве “флажка”, указывающего на успешное удаление.
В эксперименте было использовано всего три обезьяны. Все они были инфицированы SIV, а затем через двенадцать недель после заражения были переведены на АРТ. Восемь недель спустя из их крови были взяты иммунные клетки и проведена терапия gRNA/Cas9 в лабораторных условиях. Это дало положительные результаты: был легко выявлен “продукт иссечения” (короткая длина “флаговой” ДНК, которая заменила удаленную длину), а также другие генетические маркеры, указывающие на успешное иссечение.
Четыре недели спустя двум из трех обезьян была проведена терапия gRNA/Cas9, а третья обезьяна не получала никакой терапии и служила контрольной. Терапия проводилась в виде инфузии в течение 100 минут, и в общей сложности было перелито около 100 триллионов частиц аденовируса, содержащих терапию.
Три недели спустя обезьяны, получившие терапию, были подвергнуты эвтаназии, и были взяты образцы многих различных тканей организма, чтобы определить, была ли удалена ДНК SIV из инфицированных клеток. Лимфоциты, взятые из их крови, также культивировали в лабораторной чашке, чтобы определить, можно ли выделить из них вирус. Такой же анализ на рост вируса и забор тканей был проведен и у контрольной обезьяны.
Результаты
Клетки контрольной обезьяны легко продуцировали вирус в лабораторных условиях, но клетки обезьян, подвергшихся лечению, не продуцировали его.
При взятии образцов тканей в клетках, взятых из каждого органа, был обнаружен “флаговый” продукт ДНК. Этот продукт иссечения был обнаружен в 42% отдельных образцов тканей одной обезьяны и в 76% образцов другой. Плотность продукта для удаления варьировалась от одной копии на 100-1000 клеток в образцах головного мозга и спинного мозга, до 20-40 копий на клетку в образцах, взятых из селезенки и печени.
Исследователи также изучали показатели фактического удаления полного генома. Они все еще находятся в процессе исследования, но обнаружили присутствие продуктов эксцизии, указывающих на полное удаление генома, во всех образцах, взятых из селезенки и легких двух обезьян, и отсутствие какой-либо вирусной ДНК из селезенки одной и левого легкого другой, что указывает на полное удаление вируса. Они все еще находятся в процессе отбора проб лимфатических узлов, но обнаружили отсутствие какой-либо вирусной ДНК в бронхиальных лимфатических узлах одной обезьяны и паховых лимфатических узлах другой.
Вирусная ДНК все еще была обнаружена в некоторых других тканях, но, учитывая неспособность клеток продуцировать вирус, это могли быть участки “мертвой”, непродуктивной ДНК. Однако доктор Триша Бурдо, выступая с докладом, подчеркнула, что стандартной практикой является повторный анализ вирусного роста с использованием иммуностимуляторов, чтобы побудить оставшиеся клетки начать продуцировать вирус, а этого еще не было сделано.
Одна из проблем, связанных с этим видом терапии, заключается в том, что она может повредить полезные гены или активировать вредные, которые расположены рядом с местом введения вирусной ДНК, – так называемые “нецелевые” эффекты. Пока нет никаких свидетельств о каких-либо таких случайных изменениях генов.
На пресс-конференции Бурдо спросили, можно ли считать этих двух обезьян вылеченными. Она ответила, что потребуется провести еще один эксперимент, в ходе которого несколько обезьян получат терапию gRNA/Cas9, а затем посмотреть, не появится ли у них SIV повторно после прекращения АРТ, прежде чем они смогут начать говорить о лечении. Но тот факт, что об излечении говорили в контексте высоко экспериментальной терапии, эффективность которой три года назад была сомнительной, свидетельствует о том, как далеко мы продвинулись.
Рекомендации
Бурдо и др. Ex vivo и in vivo редактирование генома SIV у нечеловеческих приматов с помощью CRISPR-CAS9. Конференция по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Сиэтл, 24 ноября 2019 г.
Ознакомиться с тезисами можно на веб-сайте конференции.
Смотрите онлайн-трансляцию этой презентации на веб-сайте конференции.
