Пабло Тебас представляет выставку CROI 2019. Фото Лиз Хайлейман.
Исследователи внесли генетические изменения в Т-клетки человека, которые делают их практически невосприимчивыми к ВИЧ-инфекции, и вирусная нагрузка у ВИЧ-позитивных людей, которым были привиты эти клетки, восстанавливается медленнее, когда они прекращают терапию, как стало известно на недавней конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям (CROI 2019).
Сейчас задача состоит в том, чтобы увеличить долю клеток в организме, содержащих ген иммунитета. Возможно, это приведет к эффективному излечению от ВИЧ, при котором вирус не сможет размножаться даже в отсутствие лекарств от ВИЧ.
Главной новостью CROI 2019 стало то, что второй человек, возможно, излечился от ВИЧ-инфекции. Но в большинстве сообщений также подчеркивалось, что процедура трансплантации костного мозга, которая привела к излечению как этого пациента, так и предыдущего Тимоти Рэя Брауна 12 лет назад, опасна, дорогостояща и никогда не была бы применена к пациенту, у которого не было рака.
Так можно ли добиться аналогичного результата более безопасно? Многообещающие результаты экспериментов на животных показали обезьяны, у которых, по-видимому, большая часть ДНК ВИЧ была удалена из клеток.
Но второе исследование, на этот раз на людях, более точно воспроизвело генетические изменения, которые вылечили двух пациентов, с помощью безопасной и воспроизводимой методики. Двум вылеченным пациентам заменили Т-клетки доноров с генетической мутацией, называемой CCR5-дельта 32, которая означает, что на поверхности их клеток отсутствует молекула рецептора CCR5, к которой должны прикрепиться большинство штаммов ВИЧ, прежде чем они смогут заразить клетку.
В эксперименте, представленном доктором Пабло Тебасом (Pablo Tebas) из Пенсильванского университета в Филадельфии, Т-клетки, взятые у 15 человек с ВИЧ, были культивированы в лабораторной чашке с помощью фермента для редактирования генов, называемого нуклеазой цинкового пальца (ZFN). Это изменило их ген CCR5 таким образом, что он стал устойчивым к ВИЧ. Затем клетки были повторно введены пациентам в ходе так называемой аутологичной трансплантации, то есть модифицированный трансплантат был получен от самого пациента, поэтому проблем с отторжением возникнуть не должно.
Это не новая технология: ферменты ZFN использовались для модификации клеток в экспериментах, о которых CROI впервые сообщила в 2011 году. В этом эксперименте вирусный вектор – оболочка вируса обычной простуды – использовался для введения фермента ZFN в клетки. Реинтродуцированные CCR5-отрицательные клетки первоначально составляли около 22% популяции Т-клеток, но со временем были заменены собственными CCR5-положительными клетками пациентов.
Однако в текущей серии экспериментов для введения ZFN в клетки использовался другой метод, называемый электропорацией. Проблема с использованием вирусных векторов заключается в том, что клетки вырабатывают иммунитет к ним, поэтому их можно использовать только один раз. Электропорацию можно использовать многократно для создания нескольких циклов модифицированных клеток, которые можно прививать. При этом методе Т-клетки инкубируют вместе с ферментами ZFN в камерах в присутствии электрического тока. Это приводит к тому, что клеточные стенки становятся проницаемыми, и ZFNS или другие вещества, которые необходимо ввести, проникают в клетку.
Помимо использования другой и повторяемой методики для создания аутологичных CCR5-негативных Т-клеток, в экспериментах были рассмотрены несколько других возможностей. Во-первых, можно ли увеличить долю модифицированных Т-клеток в организме, если перед их прививкой использовать низкую дозу иммунодепрессанта (циклофосфамида), чтобы уменьшить количество CCR5-позитивных клеток в организме? А во-вторых, в то время как только 1% людей североевропейского происхождения имеют две копии гена CCR5–delta 32, что означает, что они практически невосприимчивы к ВИЧ, большая часть – до 20% – имеют одну копию этого гена (так называемая гетерозиготность). Будет ли у них лучший ответ?
В этом исследовании приняли участие 15 человек в пяти группах по три человека. Три человека не получали циклофосфамид. Шесть человек – трое гетерозиготных по CCR5 и трое без копий мутации дельта-32 – получили меньшую дозу циклофосфамида, а шесть человек – более высокую дозу. По словам доктора Тебаса, дозы были недостаточно высоки, чтобы вызвать значительную токсичность, и примерно такие же дозы использовались для лечения аутоиммунного заболевания волчанка.
Создание CCR5-негативных Т-клеток заняло около десяти недель, и циклофосфамид вводили за два дня до инфузии клеток. Восемь недель спустя все пациенты, которые были ВИЧ-инфицированными людьми с высоким уровнем CD4 (медиана CD4 831 копий/мм3), прекратили антиретровирусную терапию (АРТ). Перерыв в аналитическом лечении (ATI) был установлен на 16 недель, хотя, если по истечении этого срока у пациентов сохранялась низкая вирусная нагрузка, у них была возможность продлить курс лечения. Было обнаружено, что один человек из гетерозиготной по CCR5 группы фактически продолжал принимать АРТ и был исключен из анализа.
Существенных побочных эффектов, связанных с исследуемой терапией, не наблюдалось. Метод электропорации в однократной дозе был, по меньшей мере, столь же эффективен, как и использование аденовирусного вектора: сразу после инфузии 25% Т-клеток участников были отрицательными по CCR5.
В этом исследовании не было случаев вирусной ремиссии: во время ATI вирусная нагрузка ВИЧ у всех испытуемых вновь повысилась, а доля Т-клеток, которые были CCR5-негативными, медленно снижалась. У CCR5-гетерозиготных субъектов наблюдалась тенденция к сохранению более высокой доли CCR5-негативных инокулированных клеток. За четыре недели до ATI доля Т-клеток, которые были модифицированы, составляла 4,6% и 4,1% в двух гомозиготных (оба гена CCR5-положительные) группах, но 7,4% в гетерозиготной группе, а на 24-й неделе, через четыре недели после ATI, эта доля составляла 2,2%, 2,6% и 4,6% соответственно.
Циклофосфамид, по-видимому, не повлиял на время восстановления вируса.
Вирусная нагрузка у гетерозиготных пациентов также проявлялась медленнее. В то время как у 50% гомозиготных пациентов вирусная нагрузка была выявлена уже через четыре недели после начала ОРВИ, потребовалось целых 12 недель, прежде чем это произошло у трех из пяти гетерозиготных пациентов.
У трех испытуемых в конце курса ATI была низкая вирусная нагрузка, и они решили продлить его. У одного гомозиготного пациента в конце курса ОРВИ вирусная нагрузка была неопределяемой, и повторный курс был отложен до 12 недель спустя при вирусной нагрузке 10 000 коп/мл. У двух гетерозиготных пациентов вирусная нагрузка составляла около 1000 копий/мл, и они не возобновляли АРТ до 20 и 32 недель после ОРВИ соответственно, при вирусной нагрузке 8000 копий/мл.
Таким образом, хотя в ходе этого эксперимента не было выявлено пациентов с длительной вирусной супрессией, это демонстрация более безопасного, воспроизводимого и нетоксичного способа создания популяции устойчивых к ВИЧ Т-клеток, которые могут быть введены обратно в организм и которые могут в некоторой степени задержать восстановление вируса ВИЧ, даже если они они образуют менее 10% от общего количества Т-клеток в организме.
Отвечая на вопрос о дальнейших шагах, доктор Тебас сказал, что вместо того, чтобы просто повторять те же методы для создания CCR5-негативных клеток, его команда проведет исследования с использованием технологии ZFN для получения клеток, в которых отсутствует другой корецептор ВИЧ, C4CR4, и, в конечном итоге, для получения CRT-Т-клеток – химерных антиген-рецепторных клеток, типа искусственно сконструированные Т-клетки уже используются в противораковой терапии, которая сможет выявлять и уничтожать ВИЧ-инфицированные Т-клетки.
Рекомендации
Тебас П. и др. Задержка вирусного отскока во время ОРВИ после инфузии CD4-Т-клеток, обработанных CCR5 и ZFN. Конференция по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Сиэтл, тезисы 106, 2019.
Ознакомиться с тезисами можно на веб-сайте конференции.
Смотрите онлайн-трансляцию этой презентации на веб-сайте конференции.
